Um sistema de secreção biestável tipo III é preparado e carregado em isolados hipervirulentos de Pseudomonas aeruginosa com alterações de códon selecionadas positivamente na exsA ou exsD

O que aconteceu

Pseudomonas aeruginosa tem múltiplos fatores de virulência que promovem infecções das vias aéreas em pessoas com deficiências imunológicas. A maioria dos isolados clínicos de infecções humanas têm sistemas funcionais de secreção tipo III (T3SSs) que estão sujeitos a regulação biestável e secretam o efetor citotóxico ExoS em neutrófilos. Durante a infecção das vias aéreas em pessoas com fibrose cística (FC), P. aeruginosa mantém regulação biestável ou se adapta geneticamente inativando ou hiperativando a expressão de T3SS. Os isolados clínicos de FC com T3SS hiperativos apresentam alterações de códon nos reguladores transcricionais, exsA ou exsD. Desconhece-se como essas mutações: 1) surgem, 2) promovem hipervirulência ou 3) afetam a regulação do T3SS bistável. Para entender como esses mutantes surgem, ~24.000 genomas na base de dados NCBI Pathogens foram pesquisados por mutações selecionadas positivamente em genes exs com base em razões de mudança de códon não sinónimos. Mutações de missense e sem sentido foram detectadas em exsA (47) ou exsD (45), a maioria das quais está prevista para ser positivamente selecionada. Para determinar como uma dessas alterações de códon promove hipervirulência, um isolado exsAT48I foi usado para estabelecer infecções pulmonares em camundongos projetados com genótipo de FC. O mutante exsAT48I e o controle exsA+ apresentaram carga pulmonar semelhante, mas o primeiro causou perda de peso exacerbada e inflamação pulmonar, sugerindo imunopatologia da morte de fagócitos como causa de hipervirulência. Dois mutantes hiperativos adicionais foram identificados pela triagem de uma pequena coleção de isolados de crianças com FC. A microscopia de imunoblotting e fluorescência mostrou que os mutantes hiperativos exsA ou exsD aumentaram a produção de injectos e efetores T3SS, indicando que eles bloquearam os fenótipos (primidos e carregados). A modelagem de dímeros ExsA revelou que alterações de códon como T48I no domínio {beta}-barrel causam uma alteração conformacional que hiperativa o fator de transcrição. Esses resultados definem que mutantes hiperativos são selecionados positivamente, hipervirulentos devido à inflamação pulmonar, e têm T3SS preparado e carregado.