Detecção de proteínas MR1B endógenas em células 293F humanas por enriquecimento de imunoafinidade e coloração ocidental bidimensional

O que aconteceu

O MR1B é uma variante em splice da molécula MHC classe Ib MR1 que não possui o domínio extracelular 3 e tem sido relatado para modular a apresentação de antígeno mediada por MR1 para células T invariantes (MAIT) associadas à mucosa em células transfectadas. Embora os transcritos MR1B sejam amplamente expressos, a proteína MR1B foi relatada apenas em sistemas de superexpressão transfectados; se a proteína MR1B endógena está presente permaneceu desconhecida. Aqui relatamos a detecção da proteína MR1B endógena. O enriquecimento da imunoafinidade do lisato de células 293F (447 mg de proteína total), seguido de eletroforese bidimensional e western blotting, deu pontos imunorreativos nas coordenadas de referência MR1A (~40 kDa) e MR1B (~27-30 kDa) estabelecidas a partir de células recombinantes, cuja identidade MR1 foi confirmada por espectrometria de massas. Os pontos foram detectados com dois anti-sera levantados contra regiões em lados opostos do segmento excluído e estavam ausentes com os soros pré-imunes correspondentes; a detecção com o anti-serum C-terminal foi obtida uma vez. O ponto de 27-30 kDa encontra-se no lado básico do ponto MR1A, a direção prevista para perda do domínio 3 e oposta àquela prevista para um fragmento N-terminal modelado e não modificado de massa semelhante. A espectrometria de massa identificou a RM1 apenas nos pontos de referência recombinantes, pelo que a atribuição endógena repousa na imunorreatividade e na posição bidimensional. A proteína MR1B endógena é detectada em células 293F sob condições de não-expressão.