Desenvolvimento de um sistema de edição de genoma CRISPR-Cas9 para a bactéria extremamente termofílica Anaerocellum bescii

O que aconteceu

Anaerocellum (f. Caldicelulosiruptor) bescii é uma bactéria anaeróbia extremamente termofílica (Topto 75-78 {graus}C) e é também uma degradadora altamente eficiente da lignocelulose, tornando-se uma plataforma promissora para a engenharia metabólica. Até o momento, manipulações genéticas cromossômicas em A. bescii exigiram procedimentos multistep envolvendo recombinação homóloga com integração de vetores e contra-selecção. Aqui, demonstramos a primeira implementação da edição do genoma CRISPR-Cas9 em A. bescii facilitada por uma enzima Cas9 termoestável de Geobacillus stearothermophilus (GeoCas9). A entrega de máquinas CRISPR heterólogas através de um vetor de replicação permitiu-nos excluir individualmente e sequencialmente genes de lactato desidrogenase (ldh) e pirE em A. bescii. Em seguida, implantamos este sistema para excluir um novo alvo, triptofano sintase (trpBA), gerando uma cepa triptofano auxotrófica de A. bescii. Usando esta cepa, mostramos que a complementação trpBA permite a seleção e manutenção de um vetor replicador que expressa um gene de repórter enzimático heterólogo.