Aplicação do protocolo ORBIT para eliminação de genes alvo ao Mycobacterium abscesso

O que aconteceu

Mycobacterium abscessus (Mab) é um patógeno oportunista emergente caracterizado pela extensa resistência intrínseca à droga, ressaltando a necessidade de ferramentas genéticas precisas para definir mecanismos de patogenicidade e persistência. O sistema ORBIT (recombinação mediada por oligonucleótidos, seguida de uma meta de integração Bxb1) desenvolvido pelo grupo Sassetti permite deleções gênicas precisas, mas foi otimizado principalmente para Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium smegmatis. Embora o ORBIT tenha sido usado em Mab, aqui descrevemos um fluxo de trabalho ORBIT otimizado para eliminação eficiente do gene em Mab. Testamos parâmetros chave, incluindo seleção de plasmídeos, design de oligonucleotídeos e condições de recombinação. Avaliamos o comprimento do oligonucleotídeo e a purificação para melhorar a recuperação de mutantes alvo e estabelecemos condições que permitiram a deleção reprodutível de múltiplos genes alvo. Nossos achados estabelecem um protocolo ORBIT robusto e adaptável adaptado às características genéticas de Mab. Este fluxo de trabalho otimizado fornece um quadro prático para manipulação genética precisa e pode facilitar estudos funcionais de genes que contribuem para a fisiologia Mab, resistência antimicrobiana e patogênese.