Análise comparativa das condições de produção e ensaio cinético e parâmetros para a protease principal da SARS-CoV-2 (Mpro): uma revisão sistemática

O que aconteceu

A protease principal (Mpro) da SARS-CoV-2 desempenha um papel crucial no ciclo de replicação viral e é um alvo chave para os medicamentos antivirais COVID-19. Nesta revisão, realizamos uma extensa pesquisa bibliográfica sobre os principais desafios e limitações experimentais relatados na produção e caracterização bioquímica do Mpro. Uma grande variabilidade nos parâmetros cinéticos foi revelada, o que compromete as comparações entre vários estudos e a avaliação da eficácia do inibidor. Os estudos indicam que essas discrepâncias estão principalmente associadas a limitações experimentais, como baixa solubilidade do substrato, irregularidade óptica devido ao efeito filtro interno e variações no estado oligomérico de Mpro. Esta revisão resume e discute as diferentes estratégias de expressão de Mpro em Escherichia coli e purificação, com ênfase na obtenção de uma enzima N-terminal livre de tags, essencial para a homodimerização em uma forma altamente ativa para caracterização estrutural e funcional. Os principais substratos à base de FRET utilizados em ensaios enzimáticos foram compilados e analisados, bem como metodologias alternativas para avaliar a atividade enzimática do Mpro. Além disso, foram abordados os efeitos das condições de ensaio, como composição do tampão, pH e presença de agentes redutores. São discutidas as características estruturais intrínsecas do Mpro que impactam sua função catalítica, incluindo assimetria funcional na ligação do substrato e a cooperação alostérica positiva entre monómeros. No geral, esta revisão fornece uma perspectiva crítica e integrada sobre as principais limitações experimentais na produção e caracterização de Mpro, aplicáveis a outras proteases, contribuindo para a padronização de abordagens e avanços no desenvolvimento de inibidores mais eficazes.